mapowanie ograniczeń problem podwójnego trawienia

1. Dlaczego istnieją podwójne ograniczenia dotyczące trawienia?
2. Dlaczego mój skrót z ograniczeniami nie działa?
3. Co się stanie, jeśli dodasz za dużo enzymu restrykcyjnego?
4. Czy dwa enzymy restrykcyjne mogą ciąć w tym samym miejscu?
5. Jak obliczyć podsumowanie ograniczeń?
6. Jak długo powinno trwać podsumowanie restrykcji?
7. Czy konieczna jest inaktywacja termiczna enzymów restrykcyjnych?
8. Czy enzymy restrykcyjne wygasają?
9. Jak można zapobiegać trawieniu w wyniku ograniczeń?
10. Dlaczego enzym restrykcyjny nie miałby ciąć?
11. Jak wybrać enzymy restrykcyjne?
12. Dlaczego enzymy restrykcyjne muszą być trzymane na lodzie?

Dlaczego istnieją podwójne ograniczenia dotyczące trawienia?

Trawienie substratu DNA jednocześnie dwoma endonukleazami restrykcyjnymi (trawienie podwójne) jest powszechną procedurą oszczędzającą czas. Wybór najlepszego NEBuffera w celu zapewnienia warunków reakcji, które optymalizują aktywność enzymu, a także zapobiega aktywności gwiazdy związanej z niektórymi enzymami, jest ważną kwestią.

Dlaczego mój skrót z ograniczeniami nie działa?

Niecałkowite lub brak trawienia z powodu aktywności enzymatycznej zablokowanej przez metylację DNA. Jeśli twój enzym jest aktywny i trawi kontrolne DNA, a reakcja jest ustawiona w optymalnych warunkach, ale nadal widzisz problemy z trawieniem, może to być spowodowane tym, że enzym jest hamowany przez metylację matrycowego DNA.

Co się stanie, jeśli dodasz za dużo enzymu restrykcyjnego?

Niecałkowite trawienie może wystąpić, gdy zostanie użyte za dużo lub za mało enzymu. Obecność zanieczyszczeń w próbce DNA może hamować enzymy, powodując również niepełne trawienie.

Czy dwa enzymy restrykcyjne mogą ciąć w tym samym miejscu?

Możesz zrobić z odpowiednimi kontrolami, takimi jak pojedyncze trawienie restrykcyjne i oba enzymy razem, aby upewnić się, że oba tną niezależnie i razem, i kontynuuj swoje plany. Niestety byłem ograniczony do tych dwóch enzymów, które miały miejsca obok siebie!

Jak obliczyć podsumowanie ograniczeń?

Oblicz ilość każdego, którą musisz dodać do trawienia restrykcyjnego, aby strawić 5 μg (5000 ng) DNA 5 jednostkami enzymu. Na przykład, jeśli moje DNA ma 190 ng / ul, potrzebowałbym: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul mojej próbki.

Jak długo powinno trwać podsumowanie restrykcji?

* Pro-Tip * W zależności od zastosowania i ilości DNA w reakcji, czas inkubacji może wynosić od 45 minut do nocy. W przypadku trawienia diagnostycznego często wystarcza 1-2 godziny. Do trawienia z >1 µg DNA używanego do klonowania, zaleca się trawienie przez co najmniej 4 godziny.

Czy konieczna jest inaktywacja termiczna enzymów restrykcyjnych?

FAQ: Czy konieczna jest dezaktywacja enzymów restrykcyjnych po trawieniu wektora? Inaktywacja endonukleaz restrykcyjnych na ogół nie jest konieczna, ale w niektórych przypadkach może zwiększyć wydajność transformacji.

Czy enzymy restrykcyjne wygasają?

Aktywność wszystkich enzymów jest oznaczana co 3-6 miesięcy; data ważności jest podana na etykiecie dołączonej do każdej fiolki enzymu. Po trzydziestu pięciu latach doświadczeń z enzymami restrykcyjnymi stwierdziliśmy, że większość z nich jest bardzo stabilna, gdy jest przechowywana w temperaturze -20 ° C w zalecanym buforze do przechowywania..

Jak można zapobiegać trawieniu w wyniku ograniczeń?

Protokół Restriction Enzyme Digest Protocol

1. Dodaj komponenty do czystej rury w pokazanej kolejności: ...
2. Inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze trawienia (zwykle 37 ° C) przez 1 godzinę.
3. Zatrzymać trawienie przez inaktywację termiczną (65 ° C przez 15 minut) lub dodanie 10 mM końcowego stężenia EDTA.
4. Trawione DNA jest gotowe do użycia w zastosowaniach badawczych.

Dlaczego enzym restrykcyjny nie miałby ciąć?

Często zadawane pytania: Dlaczego mój enzym restrykcyjny nie tnie DNA? ... Jeśli DNA kontrolne jest rozszczepione, a DNA eksperymentalne jest odporne na rozszczepienie, dwa DNA można zmieszać w celu określenia, czy w próbce doświadczalnej obecny jest inhibitor. Jeśli obecny jest inhibitor (często sól, EDTA lub fenol), kontrolne DNA nie ulegnie przecięciu po zmieszaniu.

Jak wybrać enzymy restrykcyjne?

Wybierając enzymy restrykcyjne, chcesz wybrać enzymy, które:

1. Flankuj swoją wkładkę, ale nie tnij w niej.
2. Znajdują się w żądanym miejscu w plazmidzie biorcy (zwykle w miejscu wielokrotnego klonowania (MCS)), ale nie tną w innym miejscu na plazmidzie.

Dlaczego enzymy restrykcyjne muszą być trzymane na lodzie?

Czy enzymy naprawdę muszą być cały czas trzymane w lodzie? ... Enzymy muszą być przechowywane i używane w optymalnych temperaturach. Enzymy są zwykle przechowywane w glicerolu w temperaturze -20 ° C. Zapobiega to ich całkowitemu zamarznięciu, co powoduje denaturację białek i powoduje utratę aktywności.