zamawianie odwrotnych starterów

1. Jak zamawiać podkłady odwrotne?
2. Jak wybrać startery do przodu i do tyłu?
3. Jak czytać podkład do odwrotnej strony?
4. Jak wybrać starter do sekwencjonowania?
5. Co to jest podkład odwrotny?
6. Czy potrzebujesz starterów do przodu i do tyłu do sekwencjonowania?
7. Dlaczego potrzebujesz starterów do przodu i do tyłu w PCR?
8. Jak ręcznie zaprojektować podkład??
9. Dlaczego różne podkłady wymagają różnych temperatur wyżarzania?
10. Co to jest odwrotne dopełnienie?
11. Czy startery do PCR powinny być względem siebie komplementarne?
12. Czy podkłady muszą być tej samej długości?

Jak zamawiać podkłady odwrotne?

Dla startera odwrotnego: zapisz sekwencję dopełniającą końca 3 'sensownej matrycy, odwróć ją, tak aby można ją było odczytać jako 5'-3' i dodaj jakąkolwiek dodatkową sekwencję na końcu 5 'tego startera. Tak więc, dla przykładu podanego powyżej, tryb 5'-3 'startera do tyłu będzie wyglądał następująco: 5'-NNNNNNNNNN-CTCTAGAATCCTCAA-3'. To łatwe, prawda??

Jak wybrać startery do przodu i do tyłu?

Startery typu „forward” i „reverse” powinny być oddalone od siebie o około 500 pz. Koniec 3 'startera powinien być G lub C. Sekwencja genomu pochodząca z komputera to tylko jedna nić; nić komplementarna nie jest pokazana. W przypadku startera zgodnego z sekwencją można użyć bezpośrednio.

Jak czytać podkład do odwrotnej strony?

Ponieważ startery są czytane i tworzone przez ludzi, nasz starter odwrotny musi być napisany od początku do końca. Nazywa się to „odwrotnym dopełnieniem” górnej nici. 4 zasady, które wiążą się z 3 'górnej nici to TCGC. Pamiętaj jednak, że starter zaczyna się na końcu 3 ', więc należy go odczytywać jako CGCT.

Jak wybrać starter do sekwencjonowania?

Oto kilka rzeczy, o których należy pamiętać podczas projektowania własnych podkładów.

1. Długość podkładu powinna mieścić się w zakresie od 18 do 22 zasad.
2. Podkład powinien mieć zawartość GC od 50% do 55%.
3. Startery powinny mieć blokadę GC na końcu 3 '.
4. Temperatura topnienia każdego dobrego podkładu powinna mieścić się w zakresie od 50 ° C do 55 ° C.

Co to jest podkład odwrotny?

Startery to krótkie sekwencje jednoniciowego DNA, które oznaczają oba końce sekwencji docelowej. ... Primer do przodu przyłącza się do kodonu start matrycowego DNA (nić antysensowna), podczas gdy starter do tyłu do kodonu stop komplementarnej nici DNA (nić sensowna).

Czy potrzebujesz starterów do przodu i do tyłu do sekwencjonowania?

Zwykle w reakcji sekwencjonowania można zastosować starter do przodu lub do tyłu stosowany w reakcji PCR. ... Zalecamy dwie reakcje sekwencjonowania dla każdego interesującego fragmentu, aby zapewnić sekwencjonowanie dwuniciowego fragmentu. Analiza danych nie jest całkowicie dokładna dla pierwszych i ostatnich 25 zasad sekwencji.

Dlaczego potrzebujesz starterów do przodu i do tyłu w PCR?

W każdej reakcji PCR stosuje się dwa startery, starter prawy i starter odwrotny, które są zaprojektowane tak, aby flankować region docelowy do amplifikacji. ... Starter prawy wiąże się z matrycowym DNA, podczas gdy starter prawy wiąże się z drugą nicią komplementarną, z których obie są amplifikowane w reakcji PCR.

Jak ręcznie zaprojektować podkład??

Biorąc pod uwagę powyższe informacje, grunty powinny zasadniczo mieć następujące właściwości:

1. Długość podstawek 18-24.
2. 40-60% zawartości G / C.
3. Zacznij i zakończ 1-2 parami G / C.
4. Temperatura topnienia (Tm) 50-60 ° C.
5. Pary podkładów powinny mieć Tm w granicach 5 ° C od siebie.
6. Pary starterów nie powinny mieć regionów komplementarnych.

Dlaczego różne podkłady wymagają różnych temperatur wyżarzania?

W niższej temperaturze częściowe dopasowanie między starterem a matrycą będzie wystarczająco stabilne i uzyskasz amplifikację z większej liczby miejsc. Im wyższa temperatura, tym starter wymaga dłuższej kompatybilnej sekwencji do związania się, w wyniku czego twoja specyficzność będzie wyższa.

Co to jest odwrotne dopełnienie?

Odwrotne dopełnienie. Odwrotny dopełniacz przekształca sekwencję DNA w jej odwrotny, dopełniający lub odwrotny odpowiednik. Możesz chcieć pracować z odwrotnym dopełnieniem sekwencji, jeśli zawiera ona ORF na odwrotnej nici. Wklej sekwencję nieprzetworzoną lub FASTA w polu tekstowym poniżej.

Czy startery do PCR powinny być względem siebie komplementarne?

NIE! Dwa startery użyte w PCR nie powinny być komplementarne, w przeciwnym razie połączą się ze sobą i utworzą „dimer startera”. Jeśli w reakcji PCR obecny jest dimer startera, polimeraza DNA może amplifikować dimer startera, który zużywa odczynniki PCR i potencjalnie hamuje amplifikację docelowego DNA.

Czy podkłady muszą być tej samej długości?

1. Długość startera: Ogólnie przyjmuje się, że optymalna długość starterów PCR wynosi 18-22 pz. Ta długość jest wystarczająco długa, aby zapewnić odpowiednią specyficzność i wystarczająco krótka, aby startery łatwo wiązały się z matrycą w temperaturze renaturacji.