protokół hodowli komórkowej trypsyny edta

Procedura

1. Usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego przez aspirację i przemyć monowarstwę roztworem soli niezawierającym Ca.²⁺ i Mg²⁺ aby usunąć wszelkie ślady serum. ...
2. Dozuj wystarczającą ilość trypsyny lub roztworu trypsyny / EDTA do naczynia (-ów) hodowlanego (-ych), aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek i umieść w inkubatorze w 37 ° C na ~ 2 minuty.

1. Jak przygotować roztwór trypsyny EDTA do hodowli komórkowej?
2. Dlaczego trypsyna EDTA jest używana w hodowli komórkowej?
3. Jak przeprowadza się hodowlę komórek przylegających przy użyciu samych trypsyny EDTA i EDTA?
4. Jak rozmrozić trypsynę EDTA?
5. Może trypsyna zabijać komórki?
6. Co możemy dodać do kultury, aby zahamować działanie trypsyny?
7. Może zabijać komórki przez EDTA?
8. Dlaczego surowica hamuje trypsynę?
9. Jest toksyczny dla komórek EDTA?
10. Dlaczego używamy trypsyny?
11. Dlaczego myjesz komórki PBS??
12. Dlaczego myjesz komórki PBS przed dodaniem trypsyny??

Jak przygotować roztwór trypsyny EDTA do hodowli komórkowej?

Dodać 12 do 15 ml świeżej pożywki do hodowli komórek do nowej kolby i zrównoważyć tę pożywkę do odpowiedniego pH i temperatury. Zbierz zawiesinę komórek, policz ją i / lub podziel i umieść komórki w nowo przygotowanej kolbie. Zalecane proporcje subhodowli znajdują się w karcie produktu linii komórkowej.

Dlaczego trypsyna EDTA jest używana w hodowli komórkowej?

EDTA działa jako chelator metali, który jest dodawany do roztworów trypsyny w celu zwiększenia aktywności. Dodawany jest EDTA w celu usunięcia wapnia i magnezu z powierzchni komórki, co umożliwia trypsynie hydrolizę określonych wiązań peptydowych. Głównym powodem stosowania EDTA razem z trypsyną jest usunięcie adhezji między komórkami.

Jak przeprowadza się hodowlę komórek przylegających przy użyciu samych trypsyny EDTA i EDTA?

Odpipetować trypsynę / EDTA na przemytą pojedynczą warstwę komórek, używając około 1 ml na 25 cm2 powierzchni. Obróć kolbę, aby pokryć monowarstwę trypsyną. Zlej nadmiar trypsyny. Umieścić ponownie kolbę w inkubatorze i pozostawić na 2-10 minut.

Jak rozmrozić trypsynę EDTA?

Wyjmij roztwór trypsyny / EDTA z miejsca przechowywania i umieść go na noc w temperaturze od 2 ° C do 8 ° C. 2. Przenieść butelkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C i delikatnie wstrząsnąć butelką, aby wymieszać wszelkie substancje rozpuszczone. Nie przechowywać roztworu trypsyny / EDTA w 37 ° C dłużej niż to konieczne.

Może trypsyna zabijać komórki?

Inkubacja komórek o zbyt wysokim stężeniu trypsyny przez zbyt długi czas spowoduje uszkodzenie błon komórkowych i śmierć komórek.

Co możemy dodać do kultury, aby zahamować działanie trypsyny?

Trypsyna jest hamowana przez surowicę, która dostarcza dwuwartościowe kationy, takie jak wapń i magnez, które odgrywają rolę zarówno w procesie sygnalizacji wewnątrz, jak i międzykomórkowej, tj. Tworzeniu CAM, więc surowicę zwykle dodaje się do pojemnika po odłączeniu komórek - można to potwierdzić obserwacją pod mikroskop.

Może zabijać komórki przez EDTA?

za. Użyj 5 mM EDTA lub więcej UWAGA: zbyt dużo EDTA może zabić twoje komórki b. Accutase i Accumax to produkty do dysocjacji komórek sprzedawane przez innowacyjne technologie, które mogą pomóc w utrzymaniu zawiesiny pojedynczych komórek.

Dlaczego surowica hamuje trypsynę?

Cześć, Trypsyna to endopeptydaza, która trawi białka. W procesie trypsynizacji trawione są białka zewnątrzkomórkowe, co prowadzi do oderwania komórek od dna naczynia hodowlanego. ... Surowica zawiera wiele inhibitorów proteazy, które zatrzymują działanie trypsyny, głównie alfa-1-antytrypsynę. Mam nadzieję że to pomoże!

Jest toksyczny dla komórek EDTA?

Nie zaobserwowano toksyczności, gdy komórki wystawiono na działanie 100 mikroM Zn- lub Fe-EDTA, ale takie samo stężenie Cu-EDTA było tak samo toksyczne jak Na-EDTA. Ciągła ekspozycja kultur komórkowych na 5 mikroM Na- lub Zn-EDTA przez okres do 7 tygodni nie wykazała oznak toksyczności.

Dlaczego używamy trypsyny?

Trypsyna to enzym, który pomaga nam trawić białko. W jelicie cienkim trypsyna rozkłada białka, kontynuując proces trawienia, który rozpoczął się w żołądku. Może być również określany jako enzym proteolityczny lub proteinaza. Trypsyna jest wytwarzana przez trzustkę w nieaktywnej postaci zwanej trypsynogenem.

Dlaczego myjesz komórki PBS??

W hodowli komórkowej podczas rozlewania konieczne jest płukanie PBS w celu usunięcia surowicy pożywki, aby trypsyna mogła oderwać komórki od płytki, inna mądra surowica może dezaktywować trypsynę.

Dlaczego myjesz komórki PBS przed dodaniem trypsyny??

Zanim dodasz go do komórek, musisz zmyć pożywkę do hodowli komórkowej, ponieważ trypsyna rozkładałaby również białka obecne w pożywce, takie jak FCS, zmniejszając jej aktywność, zanim dotrze do komórek.